微生物学是一门在细胞、分子或群体水平上研究微生物的形态构造、生理代谢、遗传变异、生态分布和分类进化等生命活动基本规律,并将其应用于工业发酵、医药卫生、生物工程和环境保护、农业等实践领域的科学,其根本任务是发掘、利用、改善和保护有益微生物,控制、消灭或改造有害微生物,为人类社会的进步服务。
1941 Beadle与Tatlum获得营养缺陷型;
1944 Avery等证实转化过程中DNA是遗传信息的载体;
1953 Watson和Crick提出DNA双螺旋结构;
1970~1972 Arber、Smith和Nathans发现并提纯了DNA限制性内切酶。
分子生物学、分子遗传学的迅速发展以及细胞学和工程技术的融合,形成了一项崭新的技术-生物工程学。
1977 Woese提出古生菌是不同于细菌和真核生物的特殊类Sanger首次对×174噬菌体 DNA进行了全序列分析;
1982~1983Prusiner发现朊病毒(prion);
1983~1984 Mullis 建立PCR技术;
1995 第一个独立生活的细菌(流感嗜血杆菌)全基团组序列测定完成;
1996 第一个自养生活的古生菌基因组测定完成;
1997 第一个真核生物(啤酒酵母)基因组测序完成。
五. 我国的微生物学发展
六. 21世纪微生物学展望
杆菌和螺旋菌则以长和宽来表示。如1´2.5mm,杆菌直径0.5~1um ,长为直径1~几倍,螺旋菌直径0.3~1um,长1~50um。
细菌大小也不是一成不变的。
细菌的重量:每个细菌细胞重量10-13~10-12g ,大约109个E.coli 细胞才达1mg重。
研究细菌细胞结构是分子生物学重要内容之一,有了电子显微镜才有可能。其结构分为基本结构和特殊结构。
(一)细菌细胞的一般构造
基本结构是细胞不变部分,每个细胞都有,如细胞壁、细胞膜、细胞核。
①概念:细胞壁(cell wall)是细胞质膜外面具有一定硬度和韧性的壁套,使细胞保持一定形状,保障其在不同渗透压条件下生长,即使在不良环境中也能防止胞溶作用。
真细菌的细胞壁由肽聚糖构成,而古细菌细胞壁组成物质极为多样,从类似肽聚糖的物质、假肽聚糖,到多糖、蛋白质和糖蛋白。
真细菌细胞壁由肤聚糖构成,肤聚糖是N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)和带有交替排列的D-型或L-型氨基酸侧链的N-乙酰胞壁酸(NAM)的多聚体。它是高度的交联的分子,使得细胞具有刚性、强度和保护细胞抵抗渗透压的裂解。肽聚糖有许多独特的特性,如D-型氨基酸,它可作为抗生素攻击肽聚糖的靶目标(抗生素通过抑制或干扰肽聚糖合成而使细胞壁缺损)。革兰氏阳性细菌细胞还含有磷壁酸。
保护原生质体免受渗透压引起破裂的作用;维持细菌的细胞形态(可用溶菌酶处理不同形态的细菌细胞壁后,菌体均呈现圆形得到证明);细胞壁是多孔结构的分子筛,阻挡某些分子进入和保留蛋白质在间质(革兰氏阴性菌细胞壁和细胞质之间的区域);细胞壁为鞭毛提供支点,使鞭毛运动。
革兰氏染色根据1884年革兰姆·克里斯琴(Christian Gram)发明的染色反应,真细菌常常分成两类。对染色步骤反应的差别是由于两类细菌的细胞外膜结构。革兰氏阳性细菌有单一的膜称作细胞膜(或原生质膜),周围被厚的肽聚糖层包围(20~80nm)。革兰氏阴性细菌只有一薄层肽聚糖(1—3nm),但是在肽聚糖层外边,仍有另一层的外膜,作为另外的屏障(图2.3)。
革兰氏染色步骤如下:固定过的细胞用暗染色例如结晶紫染色,接着加碘液媒染,细菌细胞壁内由于染色形成结晶紫与碘的复合物。随后加酒精从薄的细胞壁中洗出结晶紫与碘暗染色的复合物,但是结晶紫—碘复合物不能从厚的细胞壁中洗出。最后,用较浅的石炭酸复红复染。加石炭酸复红染色,使脱色的细胞呈粉红色,但在暗染色的细胞中没有看到粉红色,仍保持第一次的染色结果。保持原来染色(厚的细胞壁)的细胞称作革兰氏阳性,在光学显微镜下呈现蓝紫色。脱色的细胞(薄的细胞壁和外膜)称作革兰氏阴性,染成粉红色或淡紫色。
革兰氏阳性细菌细胞壁具有较厚(30~40nm)而致密的肽聚糖层,多达20层,占细胞壁的成分60-90%,它同细胞膜的外层紧密相连(见图2.4)。
有的革兰氏阳性细菌细胞壁中含有磷壁酸(teichoi-acid),也即胞壁质(murein)。
外膜 革兰氏阴性细菌特殊的是外膜上含有许多独特的结构(见图示2.5),如把外膜与肽聚糖层连接起来的布朗(Braun’s)脂蛋白,使营养物被动运输通过膜的[膜]孔蛋白和起保护细胞作用的脂多糖(LPS)。脂多糖也称为内毒素,对哺乳动物有高度毒性。
G-细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide LPS),此外还有磷脂、多糖、和蛋白质。外膜被分为脂多糖层(外)、磷脂层(中)、脂蛋白层(内)。
肽聚糖层 G-细菌细胞壁肽聚糖层很薄,约有2-3nm厚。它与外膜的脂蛋白层相连。
周质空间 周质空间(periplasmic space,即壁膜间隙)是革兰氏阴性细菌细胞膜与外膜两膜之间的一个透明的区域(见图2.3)。它含有与营养物运输和营养物进入有关的蛋白质,有:营养物进入细胞的蛋白;营养物运输的酶,如蛋白[水解]酶;细胞防御有毒化合物,如破坏青霉素的b-内酰胺酶。革兰氏阳性细菌以上这些酶常分泌到胞外周围,革兰氏阴性细菌则依靠它的外膜,保持这些酶与菌的紧密结合。
⑥细胞壁缺陷细菌
A、原生质体(protoplast):人工条件下用溶菌酶除去细胞壁或用青霉素抑制细胞壁合成后,所留下的部分。一般由G+细菌形成。
B、球形体(spheroplast):残留部分细胞壁,一般由G-细菌形成。有一定抗性。
特点:对渗透压敏感;长鞭毛也不运动;对噬菌体不敏感;细胞不能分裂等。
C、细菌 L型:一种由自发突变形成的变异型,无完整细胞壁,在固体培养基表面形成 "油煎蛋 "状小菌落。
D、支原体:长期进化形成,独立成为柔膜菌纲,柔膜菌目。
2、 细胞膜与中间体
细胞质膜(cytoplasmic membrane),简称质膜(plasma membrane),是围绕细胞质外的双层膜结构,使细胞具有选择吸收性能,控制物质的吸收与排放,也是许多生化反应的重要部位。
原生质膜是一个磷脂双分子层,其中埋藏着与物质运输、能量代谢和信号接收有关的整合蛋白。另外,有通过电荷相互作用,疏松附着于膜的外周蛋白。膜中的脂类和蛋白质互相相对运动。
原生质膜(细胞膜)埋藏在磷脂双分子层中的是有各种功能的蛋白(图2.6),包括转运蛋白、能量代谢中的蛋白和能够对化学刺激检测和反应的受体蛋白。整合蛋白(integral)是完全地与膜连接而且贯穿全膜的蛋白,所以这些蛋白在此区域中有疏水性氨基酸埋藏在脂中。外周蛋白(peripheral proreins)是由于磷脂带正电荷极性头,只是通过电荷作用与膜松散连接的一类,用盐溶液洗涤可以从纯化的膜上除去。脂类和蛋白质均在运动,而且是彼此之间相对运动。这就是被广泛接受的称作液态镶嵌模式的细胞膜结构模型。
脂双分子层 细胞膜由含有亲水区域的和疏水区域的两亲性分子磷脂组成。在膜中磷脂以双分子层排列,极性头部亲水区指向膜的外表面,而其疏水区脂肪酸的尾部指向膜的内层。结果,膜对于大分子或电荷高的分子成为一个选择渗透屏障,它们不易通过磷脂双分子的疏水性内层。
a维持渗透压的梯度和溶质的转移;b细胞质膜是半渗透膜,具有选择性的渗透作用,能阻止高分子通过,并选择性地逆浓度梯度吸收某些低分子进入细胞;c由于膜有极性,膜上有各种与渗透有关的酶,还可使两种结构相类似的糖进入细胞的比例不同,吸收某些分子,排出某些分子;d细胞质膜上有合成细胞壁和形成横隔膜组分的酶,故在膜的外表面合成细胞壁;e膜内陷形成的中间体(相当于高等植物的粒线体)含有细胞色素,参与呼吸作用;f中间体与染色体的分离和细胞分裂有关,还为DNA提供附着点;
细胞质膜上有琥珀酸脱氢酶、NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、电子传递系统、氧化磷酸化酶及腺昔三磷酸酶(ATPase)。在细胞质膜上进行物质代谢和能量代谢;
细胞质膜上有鞭毛基粒,鞭毛由此长出,即为鞭毛提供附着点。
间体(mesosome) 是从质膜向内伸展的细胞质中主要单位膜结构,常常同核质相联系,位于细胞分裂处。间体的功能可能参与呼吸作用、同DNA的复制和细胞的分裂有关。
载色体(chromatophore) 也称为色素体,是光合细菌进行光合作用的部位,由单层的与细胞膜相连的内膜所围绕,主要化学成分是蛋白质和脂类。它们含有菌绿素、胡萝卜素等色素以及光合磷酸化所需的酶系和电子传递体。在绿硫菌科和红硫菌科中存在。
羧酶体(carboxysome) 又称为多角体,是自养细菌所特有的内膜结构,可能是固定CO2场所。
类囊体(thylakoid) 由单位膜组成,含有叶绿素、胡萝卜素等光合色素和有关酶类,在蓝细菌中为其进行光合作用的场所。
细菌细胞质是含水的、含有细胞功能所需的各种分子、RNA和蛋白质的混合物。对所有的细菌都是一样的,细胞质中的主要结构是核糖体。
核糖体 由一个小的亚基和一个大的亚基组成,核糖体的亚基是由蛋白质和RNAs组成的复合物,是细胞中合成蛋白质的场所。原核细胞中的核糖体,尽管在形状上和功能上与真核细胞相似,但是组建核糖体亚基的蛋白质和RNAs性质上有差别。古细菌的核糖体与真细菌的核糖体(70S)同样大小,但是对于白喉毒素和某些抗生素的敏感性却不同,而与真核生物的核糖体相似。业已证明抗生素对人类是非常有用的,因为抑制细菌蛋白质合成的抗生素,对真核生物蛋白质合成无效果,这样就有了选择毒性。
某些细菌含有与特殊功能相连系的结构,称作内含体(inclusion bodies) 它常常在光学显微镜下观察到。这些颗粒常是储存物,可以与膜结合,例如聚-b-经丁酸盐(PHB)颗粒;细胞质中发现的分散颗粒如多聚磷酸盐颗粒(也称为异染粒)。某些细菌中也能看到脂肪滴。一个有趣的内含体是在蓝细菌(蓝绿藻)和生活在水环境中的其他光合细菌内发现的气泡,在细胞内四周排列的由蛋白质构成的气泡提供浮力,使得细菌漂浮靠近水的表面。详情见表2.4
细菌的DNA在细胞质中为单个环状染色体,有些时候称为拟核。
细菌的DNA位于细胞质中,由一个染色体构成,不同种的细菌之间染色体大小不同(大肠杆菌染色体有4×106碱基对长)。DNA是环状、致密超螺旋,而且与真核细胞中发现的组蛋白相类似的蛋白质结合。虽然染色体没有核膜包围,但在电子显微镜中常可看到细胞内分离的核区,称为拟核(nucleoid)。
古细菌的染色体和真细菌的染色体类似,是一个单个环状的DNA分子,不包含在核膜内,而DNA分子大小通常小于大肠杆菌的DNA。
常在细菌中发现小的、染色体外的环状DNA片段,称作质粒。
某些细菌还含有染色体外的小分子DNA称作质粒(p1asmids)。其上携带的基因对细菌正常生活并非必需,但在某些情况下对细胞有利,如抗生素抗性质粒。
质粒常以不同大小的环状双螺旋存在,它可以独立进行复制,也可整合到染色体上。
而特殊结构是细胞可变部分,不是每个都有,如鞭毛、荚膜、芽孢等。
包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的透明胶状物质。糖被的有无、厚薄与菌种的遗传性相关外,还与环境尤其是营养条件密切相关。糖被按其有无固定层次、层次厚薄又可细分为荚膜(capsule或macrocapsule即大荚膜)、微荚膜(microcapsule)、粘液层(slime layer)和菌胶团(zoogloea)等数种。
糖被的功能:①保护作用,如保护细胞免受干旱损伤,保护细胞免受吞噬等;②贮藏养料,以备营养缺乏时重新利用;③作为渗透屏障和离子交换系统,以保护细菌免受金属离子的毒害;④表面附着作用,引起龋齿的streptococcus salivarius(唾液链球菌)分泌的糖被将细菌牢牢地粘附于齿表;⑤细菌间的信息识别作用;⑥堆积代谢废物。
鞭毛(flagellum,flagella)是从细胞质膜和细胞壁伸出细胞外面的蛋白质组成的丝状体结构,使细菌具有运动性。
鞭毛纤细而具有刚韧性,直径仅20nm,长度达15~20mm,可以分为三部分:基体(base body)、钩形鞘(hook)和螺旋丝(helical filament)。
具有鞭毛的细菌基鞭毛数目和在细胞表面分布因种不同而有所差异,是细菌鉴定的依据之一。一般有三类:单生鞭毛(2.7a)、丛生鞭毛(2.7b)和周生鞭毛(2.7c)。
菌毛(pili) 细菌细胞表面发现的特殊的象头发样的蛋白质表膜附属物,有几微米长。
性菌毛(sex pili) 与遗传物质从一个细菌转移到另一个细菌有关,即在细菌接合交配时起作用。性菌毛比菌毛稍长,数量少,只有一根或几根。
芽孢(endospore) 在一些属包括芽孢杆菌属和梭菌属中产生细菌的芽孢。它们是由细菌的DNA和外部多层蛋白质及肤聚糖包围而构成,芽孢对干燥和热具有高度抗性。形成芽孢的细菌:Bacillus, clostridium, Spirillum, Vibrio, Sarcina,每一细胞仅形成一个芽孢,所以其没有繁殖功能。形成芽孢属于细胞分化(形态发生)。
芽孢结构相当复杂最里面为核心,含核质、核糖体和一些酶类,由核心壁所包围;核心外面为皮层,由肽聚糖组成;皮层外面是由蛋白质所组成的芽孢衣;最外面是芽孢外壁。一般含内生芽孢的细菌总称为孢子囊(sporangium)。(见图2.8)结构组成特点:含水量低(平均40%),壁致密,芽孢肽聚糖和吡啶-2,6-二羧酸钙(DPA-Ca )。伴胞晶体——苏云金芽孢杆菌,生物农药。
芽孢在许多细菌中,主要是芽孢杆菌属和梭菌属产生一种特化的繁殖结构,(它无繁殖功能,为抗逆性休眠体)。在光学显微镜下用特殊的芽孢染色(如孔雀绿染色)或通过相差显微镜能够观察到芽孢。由于芽孢有许多层包围细菌遗传物质的结构,使得芽孢具有惊人的、对所有类型环境应力的抗性,例如热、紫外线辐射、化学消毒剂和干燥。由于许多重要的病原菌可产生芽孢,因此,必需设计灭菌措施以除去这些坚硬的结构,因为某些菌能经受住在沸水中煮沸几小时。
细菌芽孢的形成过程是细胞分化的一个典型例子,如图2.9和表2.5所示。
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细胞质膜内陷形成芽胞隔膜,将细胞分成大小不同的两个部分
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前阶段形成的较大部分细胞膜继续沿着小的细胞部分延伸并逐步将它包围,形成具有双层膜的前芽孢(forespore)
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初生皮层在前芽孢的双层膜之间形成,此时伴有毗啶二羧酸(DPA)的合成与钙离子吸收。皮层主要由肽聚糖组成。同时,在初生皮层形成过程中开始合成外壁
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皮层形成,芽胞继续发育形成具有对热和化学药物等特殊抗性的芽胞,芽胞成熟
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当细菌从周围环境中吸收了营养物质后,发生一系列的系列化合成反应,把进入的营养物质转变成为新的营养物质——DNA、RNA、蛋白质、酶及其他大分子,之后菌体开始了繁殖过程形成两个新的细胞。
裂殖是细菌最普遍、最主要的繁殖方式,通常表现为横分裂。
菌落(colony)单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体,称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时,便成为菌苔(1awn)
各种细菌在一定条件下形成的菌落特征具有一定的稳定性和专一性,这是衡量菌种纯度,辨认和鉴定菌种的重要依据。
菌落特征包括大小,形状,隆起形状,边缘情况,表面状态,表面光泽,质地,颜色,透明度等(如图2.10)。
组成菌落和细胞结构和生长行为;邻近菌落影响菌落的大小;培养条件。